理学教授兼物理研究所所长两个职位之时才应聘。
伦琴到维尔茨堡大学工作的11年里，共发表18篇论文。除最后3篇是关于发现X射线的，其它的都是论述压强对固体和液体性质所发生的效应的。
1894年，他任维尔茨堡大学校长，这正是他用能够发荧光的亚铂氰化钡屏和克鲁克斯管等做阴极射线实验而发现X射线的前一年。
那时，阴极射线的实验和克鲁克斯管已不是什么新鲜的事情，少说也有近30年的历史了。
赫兹曾发现阴极射线会穿过金属箔，他的继任者勒纳德曾在1895年发表阴极射线具有贯穿能力的论文。
伦琴觉得其中尚有一些问题值得研究，于是在1895年10月开始重做勒纳德的实验。据说，伦琴用的克鲁克斯管是从勒纳德的实验室订制的。
1895年11月8日傍晚，伦琴为了想准确地观察阴极射线的荧光作用，用黑色的硬纸片把放电管套了起来，以排除放电管与外界的相互影响。
这时他偶然看到放在1米以外的一条凳子上的亚铂氰化钡屏放出闪光。
根据阴极射线的方向和屏的位置，他断定使屏发光的不是阴极射线本身，而是一种未知的射线，他称这种射线是X射线。
为了进一步研究这一新的发现，他把自己关在实验室里，独自一人花了6个星期的时间，专心致志地重复类似的实验，观察这种射线的各种性质。
他发现，这种射线是从阴极射线轰击的玻璃管内壁上发出的，它沿直线传播，通过棱镜时不能折射和反射，不被磁铁偏转，能在空气中行进2米。
它贯穿能力很强，可以穿透千页的书，2～3厘米厚的木板，15毫米厚的铝板等，可以对关在木头盒内的金属砝码照相，乃至在照片上看到了自己手指中的骨骼。
这种魔术一般的力量即使对伦琴也是震慑心魄的。
震惊之余，他自然希望在发表这一发现之前有另外一个人来陪他重复这些实验，以证实这一发现决不是他一个人在与世隔绝的实验里所经历的梦幻。